CARACTERIZAÇÃO BIOQUIMICA

PROVAS BIOQUÍMICAS – MÉTODOS CONVENCIONAIS

1. Introdução: O Fenótipo como Espelho do Genoma

Após a obtenção de uma cultura pura por meio das técnicas de semeadura e da triagem morfológica inicial pela coloração de Gram, o laboratório de microbiologia clínica depara-se com o passo definitivo do diagnóstico: a identificação de espécie. Embora o tamanho, a forma e o arranjo celular forneçam pistas valiosas, microrganismos de gêneros completamente distintos podem apresentar morfologias idênticas sob o microscópio.

Para solucionar esse impasse, a microbiologia clássica apoia-se no estudo do perfil bioquímico e metabólico bacteriano. Cada espécie possui um conjunto único de genes que codifica enzimas específicas. Determinar a presença ou a ausência dessas enzimas — ou seja, caracterizar o fenótipo metabólico da bactéria — funciona como uma "impressão digital" química que permite decodificar a identidade do patógeno e guiar a conduta terapêutica ideal.

2. Provas Bioquímicas Rápidas de Triagem

Antes de inocular a bactéria isolada em galerias bioquímicas complexas, o analista realiza testes rápidos diretamente a partir das colônias da placa de isolamento. Esses testes separam os microrganismos em grandes blocos taxonômicos.

2.1 Teste da Catalase

Diferencia os principais gêneros de cocos Gram-positivos. A catalase é uma enzima que decompõe o peróxido de hidrogênio ($ ext{H}_2 ext{O}_2$), um subproduto tóxico do metabolismo aeróbio, em água e oxigênio molecular.

• Princípio: Adiciona-se uma gota de peróxido de hidrogênio a $3%$ sobre uma fração da colônia bacteriana disposta em uma lâmina de vidro.
• Interpretação: A formação imediata de bolhas de oxigênio (efervescência) indica um teste Catalase Positivo (característico do gênero Staphylococcus). A ausência de bolhas indica um teste Catalase Negativo (característico do gênero Streptococcus).

2.2 Teste da Oxidase (Indofenol oxidase)

Pesquisa a presença da enzima citocromo c oxidase, componente da cadeia de transporte de elétrons na respiração aeróbia.

• Princípio: A colônia é friccionada contra uma fita de papel de filtro impregnada com um reagente indicador (geralmente cloridrato de tetrametil-p-fenilenodiamina).
• Interpretação: O surgimento de uma coloração azul-escura ou roxa em até 10 a 30 segundos configura um teste Oxidase Positivo (comum em gêneros como Pseudomonas e Neisseria). A ausência de cor indica um teste Oxidase Negativo, característica marcante da vasta família Enterobacteriaceae.

2.3. Teste VP (Voges-Proskauer)  e VM (Vermelho-de-Metila)

 O meio básico é produzido por vários fabricantes. Obedece a fórmula abaixo:

 Após inoculado, incubar a 37°C, por 48 horas, ou à temperatura ambiente (+ 30°C), por 96 horas. O nóculo abundante e a temperatura mais baixa favorecem a positividade do teste, particularmente para Hafnia e Proteus mirabilis.

Para leitura, juntar para cada mililitro de cultura o reativo de Barritt:

 Como alternativa mais conveniente para rotina, juntar para cada mililitro de meio partes iguais ( + 0,5ml) de:

Solução de alfa-naftol a 6% em álcool absoluto ............... 0,5 ml

Solução aquosa de KOH a 16% ....................................... 0,5ml

Agitar bem e observar o desenvolvimento de coloração de rosa a vinho, intensa, em 15 minutos. Coloração parda deve ser desprezada.

 Reação do VM:

A 5cm³ da cultura em meio básico adicionar 5 gotas de uma solução hidroalcoólica de vermelho-de-metila.

Solução de Vermelho-de-Metila: (Dissolver 0,1g de vermelho de metila em 300 ml de álcool e adicionar 500 mk de água destilada).

3. Sistemas de Triagem em Tubos Combinados

Para o grupo dos bacilos Gram-negativos (especialmente as enterobactérias), o laboratório utiliza meios de cultura semissólidos ou inclinados em tubos de ensaio que concentram múltiplas reações bioquímicas simultâneas, otimizando o tempo e os insumos da rotina.

3.1 O Meio de Kligler (Tríplice Açúcar Ferro Modificado)

Este meio permite avaliar o perfil de fermentação de carboidratos e a produção de gases em um único tubo com ágar inclinado. Sua leitura divide-se em duas regiões anatômicas: a base anaeróbia e a rampa (topo) aeróbia.

• Fermentação da Glicose (Base): Como a glicose está presente em concentração dez vezes menor que a lactose, as bactérias a consomem rapidamente nas primeiras horas. Se a bactéria for capaz de fermentar apenas a glicose, a produção de ácidos virará o indicador vermelho de fenol para o amarelo apenas na base do tubo, enquanto o topo (rampa) retornará à cor vermelha original pela oxidação peptídica.
• Fermentação da Lactose (Rampa/Topo): Se a bactéria for capaz de fermentar também a lactose (açúcar em alta concentração), a rampa inclinada permanecerá amarela, indicando forte produção ácida contínua tanto no topo quanto na base.
• Produção de Gás: Evidenciada pela fragmentação do gel de ágar, deslocamento do meio ou presença de grandes bolhas no fundo do tubo.
• Produção de Gás Sulfídrico ($ ext{H}_2 ext{S}$): Se a bactéria degradar compostos sulfurados (como o tiossulfato de sódio), o gás $ ext{H}_2 ext{S}$ reagirá com os íons de ferro presentes no meio, gerando um precipitado negro insolúvel.

3.2 O Caldo Ureia-Indol-TODA (Multifuncional)

Este caldo líquido constitui uma poderosa ferramenta de triagem para enterobactérias, viabilizando a leitura de três parâmetros fisiológicos distintos a partir do mesmo inóculo:

1. Atividade da Urease: Avalia a capacidade bacteriana de hidrolisar a ureia, liberando amônia. A liberação de amônia alcaliniza o meio, fazendo com que o indicador vermelho de fenol vire para uma coloração vermelho-violeta ou rosa-choque intensa (um marcador clássico do gênero Proteus).
2. Produção de Indol: Mede a capacidade da bactéria de clivar o aminoácido L-triptofano através da enzima triptofanase. O indol gerado é detectado após a incubação pela adição do reagente de Kovacs, que forma um anel vermelho-rubi flutuando na superfície do líquido.
3. Triptofano Desaminase (TODA): Avalia a desaminação oxidativa do triptofano em ácido indol-pirúvico. É revelada pela adição de percloreto de ferro, que produz imediatamente uma coloração castanha ou marrom-escura nos gêneros positivos (como Proteus, Providencia e Morganella).

4. O Teste de Motilidade em Gel Semissólido

A motilidade é uma característica taxonômica essencial associada à presença de flagelos bacterianos. Para sua determinação, utiliza-se um meio contendo uma concentração reduzida de ágar ($0,5%$), o que confere consistência semissólida ao gel.

• Metodologia: Com o auxílio de uma agulha de semeadura de fio reto, realiza-se uma picada estrita vertical até o fundo do tubo, retirando a agulha exatamente pelo mesmo trajeto.
• Interpretação: Se o crescimento bacteriano ficar restrito estritamente à linha da picada, mantendo o restante do meio límpido, a bactéria é classificada como Imóvel. Se a bactéria possuir flagelos funcionais, ela migrará lateralmente a partir da linha de inoculação, promovendo uma turvação difusa por todo o tubo, classificando-a como Móvel.

5. Automação na Identificação Bioquímica

Embora as técnicas em tubos e galerias manuais (como os sistemas API) continuem sendo a base de muitos laboratórios e essenciais para o ensino acadêmico, a microbiologia clínica moderna passou por um forte processo de automação.

Os analisadores automáticos utilizam painéis miniaturizados ou cartões plásticos contendo dezenas de poços com substratos bioquímicos desidratados. O equipamento realiza a leitura fotométrica e colorimétrica automatizada de cada poço em intervalos de tempo controlados.

Os dados de mudança de cor ou fluorescência são processados por um software integrado que compara o perfil cinético gerado com um robusto banco de dados probabilístico. Isso permite a emissão do laudo de identificação bacteriana com níveis de acurácia superiores a 99%, associando frequentemente no mesmo painel o Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos (Antibiograma automatizado).