MEIOS DE CULTURA

CAPÍTULO III: MEIOS DE CULTURA NO DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO

1. Introdução e Princípios Nutricionais

Para que os microrganismos possam apresentar um crescimento adequado fora de seu habitat natural, o ambiente laboratorial deve fornecer uma associação qualitativa e quantitativa de substâncias nutritivas essenciais. Esses requisitos incluem fontes de carbono, nitrogênio, enxofre e fosfato, além da manutenção rigorosa de condições ambientais favoráveis, como potencial hidrogeniônico (pH), pressão osmótica, temperatura e umidade.

Em ecossistemas naturais, os microrganismos coexistem em populações mistas. Dessa forma, os meios de cultura constituem ferramentas fundamentais na prática clínica, pois viabilizam o isolamento, a identificação, o estudo fisiológico e a pesquisa de patógenos específicos a partir de amostras biológicas complexas.

2. Perspectiva Histórica: A Unidade Bioquímica e a Revolução do Ágar

Nos primórdios da ciência microbiológica, a multiplicação bacteriana era realizada em "caldos" rudimentares obtidos pelo cozimento de tecidos animais ou vegetais. O campo da nutrição bacteriana expandiu-se nas décadas seguintes; em 1923, o pesquisador Mueller, na tentativa de mapear compostos específicos essenciais ao crescimento, acabou por descobrir o aminoácido metionina. Com o avanço das pesquisas, consolidou-se o princípio da unidade bioquímica, revelando que os diferentes esquemas nutritivos bacterianos representam pequenas variações de um tema central. Apesar dessa evolução, a nutrição microbiana ainda impõe desafios práticos intransponíveis à rotina artificial, visto que patógenos de relevância médica como o bacilo da lepra (Mycobacterium leprae), o treponema da sífilis (Treponema pallidum) e as riquétsias permanecem incultiváveis em meios sintéticos.

Historicamente, o método inicial para contagem e isolamento de culturas puras (clones) baseava-se na técnica de diluição até a extinção (perda da infectividade). O grande salto metodológico ocorreu com a introdução dos meios sólidos por Robert Koch. Os primeiros suportes testados mostraram-se insatisfatórios: fatias de batata permitiam o crescimento confluente desordenado, enquanto a gelatina liquefazia-se sob a ação enzimática de muitos microrganismos ou em temperaturas levemente elevadas.

A solução definitiva foi proposta por Frau Hesse, esposa de um médico e bacteriologista amador alemão, que sugeriu o uso do ágar — um polissacarídeo derivado do termo malaio "agar-ágar", extraído de certas algas marinhas vermelhas. Composto primariamente por unidades de galactose com radicais sulfato, o ágar revelou-se o agente solidificante ideal: não é tóxico para as bactérias e pouquíssimas espécies conseguem degradá-lo.

Em concentrações habituais de 1,5% a  2,0%, o ágar fornece uma superfície com umidade ideal para o desenvolvimento microbiano, mantendo as colônias isoladas e fisicamente separadas. Excepcionalmente, no cultivo de microrganismos dotados de alta motilidade (fenômeno de swarming), como os do gênero Proteus, exige-se uma concentração de ágar a 5% para bloquear a formação do véu sobre a placa. Fisiologicamente, o ágar liquefaz-se entre 80^oC e 100^oC, permanecendo em estado líquido até atingir 45^oC -50^oC (temperatura tolerada por períodos curtos pelas células bacterianas); uma vez solidificado em temperatura ambiente, mantém sua estabilidade sólida muito acima dos 37^oC de incubação. Sua estrutura em gel mimetiza uma rede fibrosa compacta o suficiente para impedir a migração bacteriana interna, mas aberta a ponto de permitir a livre difusão de nutrientes e macromoléculas.

3. Preparo e Formulações de Meios Básicos e de Referência

A rotina laboratorial de microbiologia clínica requer precisão na pesagem de componentes, ajuste de pH e esterilização. Abaixo estão descritos os protocolos e formulações fundamentais baseados em infuso de tecidos, peptonas e agentes selectivos:

3.1 Caldo Simples (Meio Líquido de Base)

• Composição por Litro: Peptona (5,0g), Extrato de carne (3,0 g) e Água destilada (1000 mL).
• Preparo: Pesar os ingredientes sólidos, dissolver em água destilada, ajustar rigorosamente o pH para 7,3, distribuir na proporção de 2m, por tubo de ensaio e submeter à esterilização em autoclave a 120^oC por 15 minutos. Armazenar sob refrigeração.

3.2 Ágar Simples (Meio Sólido de Base)

• Composição por Litro: Ágar (15,0g), Peptona (5,0g), Extrato de carne (3,0g) e Água destilada (1000 mL).
• Preparo: Pesar e dissolver os constituintes sob aquecimento constante. Ajustar o pH para 7,3, esterilizar em autoclave a 120^oC por 15 minutos e distribuir o conteúdo fundido em placas de Petri estéreis, mantendo-as em geladeira após a solidificação.

3.3 Ágar Sangue e Ágar Chocolate (Meios Enriquecidos)

• Ágar Sangue: Destinado ao isolamento de patógenos fastidiosos (exigentes) e à diferenciação macroscópica do padrão de hemólise. É preparado adicionando-se sangue de carneiro desfibrinado a 5% (proporção de 0,5 mL de sangue para cada 10mL de meio base) sobre o ágar nutriente previamente fundido e resfriado à temperatura de segurança de 55^oC.
• Ágar Chocolate: Indicado para o isolamento de microrganismos altamente exigentes, como os dos gêneros Haemophilus e Neisseria. Sua confecção exige que o sangue de carneiro desfibrinado (5%) seja adicionado ao ágar base em uma temperatura mais elevada, a 70^oC. Este aquecimento induz a lise térmica dos eritrócitos, liberando fatores de crescimento intracelulares essenciais, como o Fator V (Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo - NAD), conferindo ao meio a sua coloração acastanhada característica.

3.4 Ágar Mueller-Hinton (Padrão para Antibiograma)

• Composição por Litro: Infuso de carne (300g), Casaminoácido (17,5g), Amido (1,5g) e Ágar (17g); com pH final calibrado em 7,3.
• Preparo: Suspender 38,0g do pó comercial em 1000mL de água destilada ou deionizada, aquecendo até a ebulição para a dissolução completa. Esterilizar em autoclave por 10 minutos a 15 Atm de pressão (121^oC), resfriar a 50^oC e verter em placas de Petri.

3.5 Caldo BHI (Brain Heart Infusion - Infuso de Cérebro e Coração)

• Composição por Litro: Infuso de cérebro de carneiro (200g), infuso de coração bovino (250g), peptona proteosa (10g), dextrose (2g), cloreto de sódio (5g) e fosfato dissódico (2,5g); com pH final de 7,4.
• Preparo: Dissolver 37g do pó em 1 litro de água destilada/deionizada sob agitação, seguido de autoclavação por 15 minutos a 15 Atm.

4. Classificação e Aplicação Prática dos Meios Sólidos

Os meios sólidos são categorizados funcionalmente de acordo com sua composição química e finalidade diagnóstica na triagem de amostras clínicas.

4.1 Meios de Isolamento Geral e Seletivos para Cocos Gram-Positivos

• Gelose Simples (Columbia): Meio rico adaptado para o isolamento de microrganismos frequentes em espécimes humanos. Pode ser suplementado com sangue para o crescimento de bactérias exigentes ou adicionado de misturas antimicrobianas para torná-lo seletivo.
• Gelose Columbia ANC com Sangue de Carneiro: Altamente seletivo para bactérias Gram-positivas. A incorporação dos antibióticos ácido nalidíxico e colimicina inibe o crescimento de bacilos Gram-negativos e de membros do gênero Bacillus, permitindo simultaneamente a avaliação do padrão hemolítico.
• Gelose Chapman ou Manitol Salgado (MAS): Seletivo e diferencial para o gênero Staphylococcus. Possui alta concentração de cloreto de sódio, o que restringe o crescimento da flora acompanhante. Permite a diferenciação bioquímica através da fermentação do manitol: espécies manitol-positivas (como o Staphylococcus aureus) produzem ácidos que viram o indicador de pH para a cor amarela, enquanto colônias manitol-negativas permanecem róseas.
• Gelose DNAse: Utilizado na identificação confirmatória de Staphylococcus aureus através da detecção da enzima extracelular desoxirribonuclease (DNAse), demonstrada pela degradação do DNA incorporado ao meio após revelação com ácido clorídrico.

4.2 Meios Seletivos e Diferenciais para Enterobactérias e Bacilos Gram-Negativos

• Gelose MacConkey: Isolamento seletivo e diferenciação de enterobactérias (Enterobacteriaceae). A seletividade baseia-se na presença de sais biliares e cristal violeta, que inibem bactérias Gram-positivas (com exceção do gênero Enterococcus). Contém lactose e o indicador vermelho neutro; colônias fermentadoras de lactose geram acidificação local e tornam-se rosas ou vermelhas, ao passo que as não fermentadoras apresentam-se incolores ou levemente beges.
• Gelose SS (Salmonella-Shigella): Formulado especificamente para a pesquisa desses patógenos em amostras de fezes (coprocultura). Sais biliares e corantes bloqueiam a microbiota Gram-positiva. O meio diferencia a fermentação da lactose (colônias lactose-positivas ficam rosas; lactose-negativas ficam incolores) e a redução do tiossulfato com produção de gás sulfídrico (H₂S). Bactérias produtoras de H₂S reduzem o tiossulfato na presença de ferro, gerando colônias com o centro negro; colônias incolores com ou sem centro negro constituem forte presunção de Salmonella ou Shigella.
• Gelose CLED (Cistina Lactose Eletrólito-Deficiente): Recomendado expressamente para o isolamento e quantificação de microrganismos em amostras de urina (urocultura). Permite a diferenciação de patógenos urinários lactose-fermentadores (colônias amarelas ou amarelo-esverdeadas) dos não fermentadores (colônias verdes, azuis ou incolores). A baixa concentração de eletrólitos na sua receita é crítica, pois impede o fenômeno de swarming (espalhamento) de espécies do gênero Proteus, garantindo a contagem correta de colônias isoladas.
• Gelose Yersinia (CIN): Isolamento seletivo de Yersinia a partir de inibidores como colato, desoxicolato, cristal violeta e a mistura antibiótica CIN (Cefsulodina, Irgasan e Novobiocina). A presença de manitol e vermelho neutro discrimina o gênero pela formação de colônias com centro rosa-escuro a vermelho.
• Gelose Campylose: Meio básico enriquecido com sangue e tornado seletivo para o isolamento de Campylobacter em fezes através da ação dos antimicrobianos cefoperazona, vancomicina e anfotericina B, que suprimem a flora fecal e leveduras.

4.3 Meios Seletivos para Fungos, Micobactérias e Bactérias Fastidiosas

• Gelose Sabouraud e Sabouraud Cloranfenicol-Gentamicina: Destinados ao isolamento genérico de fungos filamentosos (bolores) e leveduras. A versão acrescida da mistura antibiótica de cloranfenicol e gentamicina é mandatória para o processamento de amostras amplamente contaminadas por flora bacteriana Gram-positiva e Gram-negativa, impedindo o sobrecrescimento bacteriano.
• Meio de Löwenstein-Jensen (LJ): Formulação clássica para o isolamento de micobactérias (Mycobacterium tuberculosis). É um meio que não contém ágar em sua estrutura; sua solidificação é obtida unicamente através da coagulação térmica das proteínas do ovo que compõem a sua base rica, enriquecida ainda com asparagina e fécula. Incorpora o corante verde de malaquita como indicador e agente parcialmente seletivo.
• Meio de Loeffler: Composto por soro coagulado, este meio estimula o crescimento extremamente rápido de bactérias do gênero Corynebacterium (especialmente Corynebacterium diphtheriae), induzindo o desenvolvimento de suas granulações metacromáticas patognomônicas antes que a flora acompanhante consiga se multiplicar.
• Gelose BCYE-L: Meio tamponado (Buffered), com carvão ativado (Charcoal), extrato de levedura (Yeast Extract) e L-cisteína, desenhado para o cultivo de Legionella. A L-cisteína é um aminoácido essencial e limitante para a bactéria; o carvão ativado adsorve compostos tóxicos gerados no extrato de levedura e o sistema tampão estabiliza o pH ideal para o crescimento do patógeno.

4.4 Meios de Triagem Bioquímica e Antibiograma

• Meio de Kligler (Tríplice Açúcar Ferro modificado): Utilizado em tubos com gelose inclinada para a diferenciação de enterobactérias com base no perfil metabólico de carboidratos. Na base do tubo, a fermentação da glicose (açúcar em baixa concentração) promove a acidificação e vira o indicador vermelho de fenol para a cor amarela. Se houver produção de gás, observam-se bolhas ou fragmentação do gel; a produção de H₂S reage com o citrato de ferro, gerando um precipitado negro. Na rampa inclinada superior, a fermentação da lactose (açúcar em alta concentração) mantém o topo do tubo amarelo.
• Meio para Teste de Motilidade: Formulado com triptose, cloreto de sódio e uma concentração reduzida de ágar-ágar (5,0 g/L), criando um gel semissólido que permite a migração macroscópica de bactérias móveis a partir da linha de picada inoculada.
• Gelose Mueller-Hinton (MH): Meio oficial padronizado para a execução do teste de sensibilidade aos antimicrobianos (antibiograma) por difusão em disco. Sua fórmula garante o crescimento de bactérias não exigentes com mínima interferência dos componentes nos halos de inibição. Seus níveis de íons bivalentes (Ca²⁺ e Mg²⁺) são ajustados para assegurar a precisão nos testes de Pseudomonas frente a aminoglicosídeos e tetraciclinas, e seu teor de timina-timidina é rigidamente baixo para evitar a inibição artificial da atividade de sulfamidas. Para o gênero Haemophilus, utiliza-se o Meio Teste Haemophilus (HTM), suplementado e livre de antagonistas.

5. Classificação e Aplicação Prática dos Meios Líquidos (Caldos)

Os caldos funcionam primariamente como meios de enriquecimento, aumentando a carga de patógenos que se encontram em baixas concentrações ou em amostras polimicrobianas.

• Meio de Tioglicolato: Caldo universal de enriquecimento para o isolamento de bactérias aeróbias, anaeróbias e microaerófilas em amostras biológicas com baixa carga microbiana inicial. Devido ao gradiente de oxigênio gerado ao longo do tubo, torna-se supérfluo incubar os tubos em câmaras de anaerobiose, sendo também muito aplicado no controle de esterilidade industrial.
• Meio de Selenito (Meio de Leifson) e Meio de Tetrationato (Muller-Kauffmann): Caldos de enriquecimento altamente seletivos para o isolamento de Salmonella a partir de amostras de fezes. Suas composições (contendo selenito de sódio no primeiro; tetrationato, bile e verde brilhante no segundo) atuam inibindo de forma contundente a microbiota entérica normal, favorecendo a multiplicação seletiva da Salmonella.
• Água de Peptona Alcalina: Caldo peptonado com 10% de cloreto de sódio e pH hiperalcalino calibrado em 8,8. É indicado para o enriquecimento de Vibrio cholerae em suspeitas clínicas de cólera, pois o pH extremamente alcalino bloqueia a maioria das outras bactérias intestinais.
• Meio de Ureia-Indol: Caldo multifuncional para identificação rápida de enterobactérias. Permite detectar de forma simultânea:
1. Urease: Se a bactéria hidrolisar a ureia, ocorre a alcalinização do meio e o indicador vermelho de fenol vira para vermelho-violeta.
2. Indol: A degradação do L-triptofano pela enzima triptofanase gera indol, revelado pela adição do reagente de Kovacs, formando um anel vermelho na superfície.
3. TODA (Triptofano Desaminase): Avaliada pela formação de ácido indol-pirúvico que, na presença de percloreto de ferro, confere uma coloração castanha ao meio.

6. Sistemas de Transporte de Amostras Clínicas

A manutenção da viabilidade celular entre o momento da coleta biológica e o processamento técnico exige meios de transporte sem carga de nutrientes, impedindo a multiplicação desordenada mas preservando os patógenos.

• Portagerm: Meio sólido de transporte para conservação de agentes aeróbios e anaeróbios. O ágar restringe a difusão do oxigênio atmosférico e agentes redutores químicos eliminam o oxigênio livre. Possui o indicador resazurina para monitoramento visual: se o meio se apresentar azul, há presença de oxigênio (inviabilizando anaeróbios); se estiver incolor, confirma-se a atmosfera segura de anaerobiose.
• Meio de Amies com Carvão: Sistema tamponado adicionado de carvão ativado, indispensável para garantir a sobrevida de bactérias fastidiosas e sensíveis como a Neisseria gonorrhoeae em swabs de exsudatos vaginais, uretrais ou orofaríngeos.
• Meio de Cary-Blair: Formulado com baixo conteúdo de nutrientes para evitar a multiplicação bacteriana, associado ao tioglicolato (que garante baixo potencial de oxirredução) e a um pH elevado. É o meio de eleição para o transporte de amostras fecais em swabs retais, sendo crítico para a preservação de patógenos entéricos sensíveis, como as espécies de Campylobacter.

7. Protocolo Operacional Padrão (POP): Preparo de Meios de Cultura

7.1. Objetivo

Estabelecer o procedimento padrão para o preparo, ajuste e esterilização de meios de cultura, garantindo a qualidade necessária para o isolamento, identificação e estudo fisiológico de microrganismos.

7.2. Requisitos Básicos

Para um crescimento adequado, o meio deve fornecer:

• Fontes Nutritivas: Carbono, nitrogênio, enxofre e fosfato.
• Condições Ambientais: Controle rigoroso de pH, pressão osmótica, umidade e temperatura.

7.3. Procedimento Geral (Fluxo Operacional)

O preparo segue etapas fundamentais que devem ser seguidas com precisão:

7.4. Notas Específicas para Formulações Comuns

7.4.1 Meios Sólidos

• Agente Solidificante: O ágar deve ser utilizado em concentrações habituais de 1,5% a 2,0%.
• Motilidade: Para microrganismos com alta motilidade (Proteus), utilizar 5% de ágar.
• Temperatura de Trabalho: O ágar fundido deve ser resfriado a uma faixa entre 45°C e 50°C antes da manipulação ou adição de suplementos sensíveis ao calor.

7.4.2 Meios Enriquecidos (Sangue e Chocolate)

• Ágar Sangue: Adicionar sangue de carneiro desfibrinado (5%) ao meio base após resfriamento a 55°C.
• Ágar Chocolate: Adicionar o sangue (5%) a 70°C. O calor induz a lise dos eritrócitos, liberando fatores essenciais (como o Fator V).

7.5. Cuidados Adicionais

• Meios Especiais: Alguns meios, como o Löwenstein-Jensen, não utilizam ágar, dependendo da coagulação térmica de proteínas (ex: ovo) para sua solidificação.
• Meios Seletivos: Sempre respeitar a inclusão de inibidores (antibióticos, corantes ou sais biliares) conforme a finalidade diagnóstica pretendida para o isolamento de patógenos específicos.

REFERÊNCIAS:

BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Manual de procedimentos básicos em microbiologia clínica para o controle de infecção hospitalar: Módulo I. Brasília: ANVISA/Ministério da Saúde, 2000. 56 p. Disponível em: https://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/manual_procedimentos_microbiologiaclinica_controle_infechospitalar.pdf. Acesso em: 30 maio 2026.

CARROLL, K. C. et al. (ed.). Manual of Clinical Microbiology. 12. ed. Washington, DC: ASM Press, 2019.

TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. L. Microbiologia. 12. ed. Porto Alegre: Artmed, 2017.

WADSWORTH, J.; FINEGOLD, S. M.; BARON, E. J. Bailey & Scott's Diagnostic Microbiology. 14. ed. St. Louis, MO: Elsevier, 2017.