CULTURA DE FUNGOS

CULTURA DE FUNGOS (MICOLOGIA CLÍNICA)

  1. Introdução e Fisiologia Fúngica Aplicada ao Diagnóstico

 

O estudo da micologia clínica dedica-se ao isolamento e à identificação de fungos (leveduras e fungos filamentosos/bolores) causadores de infecções superficiais, cutâneas, subcutâneas e sistêmicas profunda. Ao contrário das bactérias, os fungos são organismos eucarióticos que possuem parede celular rígida composta de quitina e glucanas, apresentando um metabolismo e tempo de replicação consideravelmente mais lentos.

Para o sucesso do diagnóstico laboratorial, o microbiologista deve dominar as particularidades do cultivo fúngico. Enquanto as leveduras formam colônias úmidas e pastosas que mimetizam macroscopicamente o crescimento bacteriano, os fungos filamentosos desenvolvem hifas que se entrelaçam formando o micélio (vegetativo e reprodutivo), com colônias de aspecto algodonoso, aveludado ou pulverulento. A caracterização definitiva dessas estruturas fundamenta-se na preservação dos seus corpos de frutificação e esporos, exigindo técnicas de cultivo e manipulação específicas que diferem da rotina bacteriológica convencional.

  1. Dinâmica dos Meios de Cultura e Agentes Inibidores

O isolamento de fungos a partir de amostras biológicas (especialmente sítios não estéreis, como pele, unhas, escarro e secreções) exige o uso estratégico de meios seletivos para evitar que bactérias da microbiota normal ou fungos saprófitas de crescimento rápido mascarem os verdadeiros patógenos.

2.1 O Papel do Ágar Sabouraud e Aditivos

  • Ágar Sabouraud Dextrose: É o meio de base universal para o cultivo micológico. Seu pH levemente ácido (5,6) e alta concentração de glicose favorecem o desenvolvimento fúngico, embora ainda permitam o crescimento de algumas bactérias.
  • Uso de Antibacterianos: Para suprimir o sobrecrescimento bacteriano, adicionam-se rotineiramente ao meio antibióticos de largo espectro, como o cloranfenicol ou a gentamicina.
  • O Uso Crítico da Ciclo-heximida (Actidione): A ciclo-heximida é um agente antifúngico adicionado a meios seletivos (como o Ágar Mycosel ou Ágar Sabouraud com Actidione) com o objetivo específico de inibir o crescimento de fungos saprófitas e contaminantes ambientais de crescimento rápido (como alguns zigomicetos), que destruiriam a placa antes do surgimento dos patógenos de crescimento lento.

2.2 Alerta de Restrição Metabólica (Controle de Qualidade)

CUIDADO EM MICOLOGIA: A ciclo-heximida inibe o crescimento de fungos patogênicos de alta relevância clínica. Portanto, o laboratório deve, obrigatoriamente, processar a amostra em paralelo utilizando um meio sem esse aditivo. Os principais agentes patogênicos e oportunistas severamente inibidos pela ciclo-heximida são:

  • Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii (agentes de meningite criptocócica).
  • Aspergillus fumigatus (agente de aspergilose pulmonar/sistêmica).
  • Penicillium marneffei (atualmente denominado Talaromyces marneffei).
  • Scedosporium prolificans.
  • Algumas espécies específicas do gênero Candida e a totalidade dos zigomicetos (agentes da mucormicose).

Adicionalmente, recomenda-se a inclusão de um meio de enriquecimento na rotina para garantir a perfeita recuperação e reversão de fungos fastidiosos e dimórficos presentes em amostras profundas.

  1. Condições e Prazos de Incubação

Os requisitos térmicos e cronológicos na micologia clínica são amplos e requerem rigorosa gestão laboratorial:

  • Temperatura de Eleição: A temperatura padrão para incubação e crescimento dos fungos clinicamente relevantes é de 30oC. Caso o laboratório não disponha de uma estufa calibrada nesta temperatura, indica-se a manutenção dos meios à temperatura ambiente (aproximadamente 25oC).
  • Incubação a 35oC - 37 oC: Não há vantagem epidemiológica ou analítica em incubar culturas primárias rotineiramente nessa faixa térmica. Essa conduta é reservada exclusivamente para o estudo da transição morfológica de fungos dimórficos (confirmando a fase de levedura de patógenos como Paracoccidioides spp., Histoplasma spp. e Sporothrix spp.).
  • Cronograma de Guarda (Prazos de Descarte):
    • Prazos Curtos (48 horas): Culturas de secreção vaginal, orofaringe, urina ou amostras semeadas em meios cromogênicos (voltados à identificação rápida de espécies de Candida) podem ter seus laudos negativos liberados em 48 horas.
    • Prazo Padrão (4 semanas): A maioria das culturas micológicas gerais de rotina (pele, unha, cabelo e secreções profundas) deve ser mantida sob monitoramento por um período máximo de 4 semanas antes de ser emitido um laudo negativo.
    • Prazos Estendidos (8 semanas): Em investigações com forte suspeita clínica ou epidemiológica de fungos dimórficos (como a paracoccidioidomicose ou histoplasmose), as placas e tubos devem ser guardados e monitorados por até 8 semanas antes da liberação do resultado negativo final.
  1. Técnica de Microcultivo para Fungos (Câmara Úmida)

Para a identificação precisa de fungos filamentosos (bolores), a simples coleta de material da colônia com alça destrói o arranjo natural dos esporos e conídios. A técnica de microcultivo (ou cultura em lâmina) fundamenta-se no crescimento do fungo em pequenos blocos de meio de cultura dispostos entre uma lâmina e uma lamínula. À medida que o micélio se expande, as hifas e os corpos de frutificação fixam-se intactos na porção inferior da lamínula, permitindo a análise microscópica da sua arquitetura original.

Protocolo de Execução Técnica

  1. Montagem da Câmara Úmida: No interior de uma placa de Petri estéril, colocar uma lâmina de vidro, uma lamínula e um chumaço de algodão hidrófilo. Acondicionar o conjunto e esterilizar em autoclave.
  2. Preparo do Bloco de Ágar: Com o auxílio de um estilete ou alça de platina estéril, cortar o ágar Sabouraud (preparado previamente em outra placa) em pedaços quadrados de aproximadamente 15 mm de lado. Depositar este bloco sobre a lâmina estéril contida na placa de Petri.
  3. Inoculação e Fechamento: Inocular fragmentos da colônia fúngica em análise (ou o próprio material biológico) nos quatro lados (bordas) do bloco de ágar. Cobrir o bloco imediatamente com a lamínula estéril.
  4. Ativação da Câmara Úmida: Adicionar cerca de 2 mL de água destilada estéril sobre o chumaço de algodão dentro da placa. Nota didática: A água satura o ambiente, impedindo o dessecamento do bloco de ágar ao longo das semanas de incubação. Tampar a placa de Petri e incubar a 30oC  (ou temperatura ambiente).
  1. PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO (POP): CULTURA E MICROCULTIVO DE FUNGOS

5.1. OBJETIVO

Padronizar as etapas de triagem, inoculação em meios seletivos, condições de incubação, montagem de microcultivo e análise microscópica de fungos filamentosos no laboratório de micologia clínica.

5.2. MATERIAIS, REAGENTES E EQUIPAMENTOS

  • Placas e tubos de ágar Sabouraud Dextrose com Cloranfenicol.
  • Tubos de ágar Mycosel (com ciclo-heximida).
  • Lâminas, lamínulas e pinças estéreis.
  • Solução corante de Azul de Metileno (ou Azul de Algodão em Lactofenol).
  • Água destilada estéril.
  • Placas de Petri contendo suporte de vidro e algodão (kits de câmara úmida esterilizados).
  • Estiletes, bisturis e alças de platina em L.
  • Microscópio óptico binocular.
  • Estufa bacteriológica/micológica regulada a 30 oC.
  • Cabine de Segurança Biológica Classe II (Fluxo Laminar) — Obrigatória para manipulação de fungos filamentosos.

 

5.3. PROCEDIMENTO PASSO A PASSO

Passo 1: Triagem e Semeadura Primária

  1. Segurança em Primeiro Lugar: Toda manipulação de culturas fúngicas suspeitas de exibirem a forma filamentosa deve ser realizada obrigatoriamente dentro da Cabine de Segurança Biológica para evitar a inalação de esporos pelo operador.
  2. Inocular a amostra biológica simultaneamente em:
    • 1 tubo/placa de Ágar Sabouraud com Cloranfenicol (permite o crescimento de fungos fastidiosos e leveduras sensíveis).
    • 1 tubo de Ágar Mycosel (restringe contaminantes, selecionando dermatófitos e outros patógenos tolerantes).
  3. REGRA CRÍTICA DE INCUBAÇÃO: Não inverter as placas de Petri durante o período de incubação em micologia, como se faz rotineiramente na rotina bacteriológica. As placas devem ser incubadas na posição normal (tampa para cima) para evitar que a condensação da água caia sobre o micélio em desenvolvimento e desfaça a distribuição aérea das colônias e esporos.
  4. Incubar a 30 oC (ou temperatura ambiente).

 

Passo 2: Montagem do Microcultivo (Diante de Bolores Isolados)

Se a cultura primária revelar o crescimento de um fungo filamentoso não identificado:

  1. Abrir a placa da câmara úmida estéril dentro do fluxo laminar.
  2. Com o auxílio de um estilete estéril, cortar um bloco quadrado (15mm) de ágar Sabouraud e transferi-lo para o centro da lâmina de microscopia contida na câmara úmida.
  3. Coletar uma fração mínima do micélio jovem da colônia com a ponta do estilete e tocar suavemente as quatro faces laterais do bloco de ágar.
  4. Com uma pinça estéril, colocar a lamínula sobre o bloco de ágar, exercendo uma leve pressão.
  5. Umedecer o algodão com 2 ml de água estéril. Fechar a placa de Petri e incubar a 30 oC. Inspecionar a placa a cada 48 horas à procura de crescimento hifal visível sob a lamínula.

 

Passo 3: Confecção e Leitura da Lâmina Definitiva

  1. Assim que o crescimento fúngico preencher a área sob a lamínula (geralmente entre 5 e 12 dias), retirar a placa da estufa.
  2. Em uma nova lâmina de microscopia limpa, depositar uma gota do corante Azul de Metileno (ou azul de algodão).
  3. Utilizando uma pinça, remover delicadamente a lamínula do microcultivo (removendo junto o bloco de ágar exaurido, que deve ser descartado no lixo biológico). A porção inferior da lamínula conterá as hifas e conídios aderidos.
  4. Depositar a lamínula com o lado do crescimento fúngico voltado para baixo, diretamente sobre a gota de corante contida na nova lâmina. Remove-se o excesso de corante com papel filtro se necessário.
  5. Analisar ao microscópio óptico nas objetivas de 10X e 40X.

 

5.4. CRITÉRIOS DE INTERPRETAÇÃO MICROSCÓPICA

O analista deve buscar os critérios universais de identificação micológica:

  • Morfologia das Hifas: Verificar se são hialinas (transparentes) ou demáceas (escuras); septadas ou cenocíticas (sem septos).
  • Corpos de Frutificação e Esporos: Caracterizar o arranjo estrutural para a diferenciação dos gêneros clássicos:

  

5.5. REGISTROS E EMISSÃO DE LAUDOS

  • Culturas Negativas de Rotina: Se após 4 semanas (28 dias) de monitoramento não houver crescimento hifal ou leveduriforme, reportar: "Ausência de crescimento de fungos após 4 semanas de incubação a 30ºC."
  • Culturas Negativas para Dimórficos: Se após 8 semanas (56 dias) não houver crescimento em amostras de triagem profunda, reportar: "Ausência de crescimento de fungos dimórficos após 8 semanas de incubação."
  • Culturas Positivas: Emitir o laudo especificando o gênero e, sempre que possível através da micromorfologia, a espécie isolada (Ex: "Isolamento de Aspergillus fumigatus" ou "Isolamento de Trichophyton mentagrophytes").
  1. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS (NORMAS ABNT)

BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Microbiologia Clínica para o Controle de Infecção Relacionada à Assistência à Saúde: Módulo 4: Procedimentos Laboratoriais: Da requisição do exame à análise microbiológica e emissão do laudo. Brasília, DF: ANVISA, 2013.

 

SOCIEDADE BRASILEIRA DE PATOLOGIA CLÍNICA/MEDICINA LABORATORIAL (SBPC/ML). Recomendações da Sociedade Brasileira de Patologia Clínica/Medicina Laboratorial: Boas Práticas em Microbiologia Clínica. Coordenação de Henis Madi. Barueri: Manole, 2015.