COLORAÇÃO DE GRAM - BACTERIOSCOPIA

A COLORAÇÃO DE GRAM NA ROTINA DIAGNÓSTICA - BACTERIOSCOPIA

1. Introdução e Histórico

Em 1884, o médico dinamarquês Cristian Gram descobriu de forma empírica uma das metodologias mais perenes da ciência médica. Ao corar cortes histológicos com violeta de genciana por meio do método de Ehrlich (1882), Gram observou que as bactérias ali presentes não perdiam a cor quando tratadas previamente com uma solução de iodo e lavadas com álcool. Ao adicionar um contracorante (como a safranina ou a fucsina básica) ao procedimento, ele estabeleceu as bases da coloração diferencial.

Ao longo dos anos, embora muitas modificações tenham sido propostas, a ideia original permaneceu substancialmente inalterada , tornando-se uma ferramenta de elevadíssima significação taxonômica e diagnóstica na microbiologia moderna.

2. Objetivos e Princípios Fundamentais

A coloração de Gram tem por objetivo primário permitir a observação de formas, da disposição celular e do comportamento tintorial das bactérias, distinguindo-as em dois grandes grupos: Gram-positivas e Gram-negativas.

Adicionalmente, o método é fundamental para a caracterização morfológica bacteriana celular, determinando:

• Comportamento tintorial: Capacidade de reter ou não o corante primário (violeta de genciana/cristal violeta).
• Forma: Classificação em cocos (esféricos), bacilos (cilíndricos) e espirilos (espiralados).
• Arranjo: A disposição espacial que as células assumem entre si após realizarem a divisão celular. Os cocos podem se apresentar isolados, aos pares (diplococos), organizados em cadeia (estreptococos) ou agrupados em cachos (estafilococos). Já os bacilos e espirilos apresentam-se, em geral, como células isoladas, embora ocasionalmente observem-se bacilos aos pares (diplobacilos) ou dispostos em cadeia (estreptobacilos).

Nota sobre o Tamanho Bacteriano: As células bacterianas possuem dimensões estritamente microscópicas. A maioria delas apresenta um diâmetro que varia de 0,2  a  1,5 micrometros e comprimento situando-se entre 1 a  6 micrometros.

3. Preparo de Reagentes e Materiais

Para a execução técnica do método de Gram, são necessários reagentes específicos configurados em soluções de uso e materiais de suporte laboratorial:

3.1 Reagentes de Gram

• Cristal Violeta (Corante Primário): Preparado a partir da mistura de duas soluções:
• Solução A: Cristal-violeta (2 g) dissolvido em álcool etílico (20mL).
• Solução B: Oxalato de amônio (0,8 g) dissolvido em água destilada (80 mL).
• Lugol (Mordente): Composto por iodo (1g) e iodeto de potássio (2g) homogeneizados em água destilada (300 mL).
• Agente Descorante: Mistura de álcool-acetona.
• Safranina (Contracorante ou Corante de Fundo): Composta por uma solução estoque (2,5 g/ 100 mL) que deve ser diluída na proporção de 1/10 em água para a solução de uso.

3.2 Materiais de Apoio

Lâminas de vidro, suporte para lâminas, alça de platina, bico de Bunsen, microscópio óptico e óleo de imersão.

4. Procedimento Técnico (Metodologia)

O protocolo deve ser executado de forma sequencial e respeitando rigorosamente os tempos de exposição a cada reagente:

1. Preparo e Fixação: Preparar o esfregaço bacteriano na lâmina e fixá-lo ao calor (passagem leve pela chama do bico de Bunsen).
2. Coloração Primária: Cobrir a área do esfregaço com a solução de cristal-violeta por aproximadamente 1 minuto.
3. Lavagem Intermediária: Lavar suavemente com água corrente e escorrer todo o excesso.
4. Tratamento com Mordente: Cobrir o esfregaço com a solução de iodo (Lugol) durante cerca de 1 minuto.
5. Descoloração: Diferenciar a lâmina gotejando a mistura álcool-acetona até que o solvente escorra completamente incolor.
6. Contracoloração: Cobrir o esfregaço com a solução de safranina por cerca de 30 segundos.
7. Lavagem Final e Secagem: Lavar com água corrente e deixar a lâmina secar naturalmente ao ar antes da leitura microscópica.

5. Fundamentos Químicos e Mecanismo da Parede Celular

A resposta diferencial das bactérias ao método baseia-se diretamente nas particularidades de composição química e espessura da parede celular bacteriana.

5.1 Bactérias Gram-positivas

Apresentam uma parede celular espessa, composta majoritariamente por uma densa camada de mureína (peptídeoglicano – formado por peptídeo de ácido N-acetyl murâmico). Quando expostas ao cristal-violeta e ao lugol, ocorre a formação intracelular do complexo iodo-pararosanilina.

Durante a etapa de descoloração com o álcool ou acetona, o solvente promove a desidratação da parede celular, gerando a diminuição da sua porosidade e da sua permeabilidade. Com isso, o complexo iodo-pararosanilina fica retido na malha de peptídeoglicano. Elas resistem à descoloração, não são afetadas pelo contracorante e permanecem com a coloração violeta ou azul sob o microscópio.

A importância do peptídeoglicano na retenção do corante é demonstrada pelo fato de que protoplastos (células bacterianas desprovidas de parede por ação de lisozimas ou penicilina) perdem totalmente a capacidade de reter o pigmento roxo quando lavados com álcool. O ribonucleato de magnésio também atua como mediador biológico nessa fixação.

5.2 Bactérias Gram-negativas

Possuem uma parede celular mais delgada, onde a presença de peptídeoglicano é minoritária, sendo a estrutura composta predominantemente por ácidos graxos, organizados em lipopolissacarídeos e lipoproteínas.

Quando o álcool ou a acetona são aplicados, ocorre a extração desses lipídios da parede externa , o que acarreta um aumento significativo da porosidade e da permeabilidade celular. O complexo iodo-pararosanilina é removido rapidamente pelo solvente, deixando a célula incolor. Ao aplicar o contracorante safranina, as estruturas descoradas absorvem o pigmento de fundo , assumindo a coloração rósea ou vermelha.

6. Fatores Críticos e Correlação Taxonômica

6.1 Estado Fisiológico da Cultura

A reação de Gram possui íntima relação com o estado fisiológico celular. Culturas bacterianas jovens (em fase ativa de crescimento) respondem com máxima fidelidade à diferenciação tintorial. Culturas velhas de bactérias Gram-positivas tendem a perder a integridade estrutural da parede e a capacidade de reter o complexo, manifestando-se erroneamente como Gram-variáveis.

6.2 Correlação Taxonômica Geral

Como regra taxonômica geral de orientação diagnóstica clínica, observa-se o seguinte padrão de comportamento biológico:

7.1. Objetivos da Bacterioscopia Clínica

O exame bacterioscópico não visa apenas detectar a presença de elementos bacterianos na amostra, mas também fornecer uma triagem taxonômica e morfológica detalhada. Seus objetivos precípuos na rotina diagnóstica incluem a determinação de três critérios fundamentais:

• Comportamento Tintorial: Classifica as bactérias com base na composição físico-química de suas estruturas envoltórias, separando-as em grupos distintos (como Gram-positivas ou Gram-negativas) conforme o corante retido.
• Forma (Morfologia Celular): Permite discriminar se as células bacterianas possuem formato esférico (cocos), cilíndrico ou de bastonete (bacilos) ou espiralado (espirilos).
• Arranjo (Disposição Espacial): Identifica a organização das células bacterianas entre si após o processo de divisão celular. Os cocos, por exemplo, podem se dispor isolados, em pares (diplococos), organizados em filamentos lineares (estreptococos) ou agrupados em massas tridimensionais semelhantes a cachos (estafilococos). Bacilos e espirilos tendem a se apresentar majoritariamente isolados, embora arranjos em pares (diplobacilos) ou cadeias (estreptobacilos) também possam ser visualizados.

     Adicionalmente, a análise bacterioscópica de amostras biológicas diretas (como escarro, líquor ou secreções) permite avaliar a qualidade do material clínico pela quantificação de células inflamatórias (leucócitos/neutrófilos) e células de descamação epitelial, além de evidenciar se há fagocitose bacteriana ativa.

7.2. Requisitos Técnicos e Execução do Exame

Para garantir a fidedignidade de um laudo bacterioscópico, o analista clínico deve dispor de uma infraestrutura física apropriada, dotada de uma sala ou câmara asséptica para a manipulação de materiais biológicos, e uma área de expurgo para a descontaminação biológica posterior.

Protocolo Operacional Padrão (POP)

1. Confecção do Esfregaço e Fixação: Utilizando uma alça de platina esterilizada na chama do bico de Bunsen, espalha-se uma fina camada da amostra ou colônia sobre uma lâmina de vidro limpa. Deixa-se secar ao ar e, em seguida, fixa-se o material passando a lâmina levemente pelo calor da chama.
2. Coloração Primária: Cobre-se o esfregaço com a solução de cristal-violeta por 1 minuto. Lava-se suavemente com água corrente.
3. Tratamento com Mordente: Aplica-se a solução de Lugol por 1 minuto para estabilizar o corante primário. Lava-se novamente.
4. Descoloração (Etapa Crítica): Goteja-se a mistura de álcool-acetona sobre a lâmina inclinada até que o solvente escorra completamente incolor, interrompendo o processo imediatamente com água. O superdescoramento pode fazer Gram-positivas parecerem Gram-negativas.
5. Contracoloração: Cobre-se o material com a solução de safranina de uso por 30 segundos. Lava-se e deixa-se secar ao ar.

7.3. Fatores Críticos e Limitações na Interpretação

A interpretação de uma lâmina bacterioscópica exige discernimento técnico e conhecimento do estado fisiológico bacteriano. O estudante e o profissional devem estar atentos às seguintes variáveis que podem comprometer os resultados:

• Idade da Cultura: A reação de Gram é diretamente influenciada pelo estado fisiológico celular. Culturas jovens (geralmente entre 18 e 24 horas de incubação) respondem com máxima fidelidade ao comportamento tintorial. Culturas velhas de bactérias Gram-positivas sofrem autólise natural ou perda de integridade da parede celular, tornando-se incapazes de reter o cristal-violeta e manifestando-se de forma errônea como Gram-variáveis (células roxas e rosas mescladas no mesmo campo).
• Espessura do Esfregaço: Esfregaços excessivamente densos ou grossos impedem a penetração uniforme dos corantes e dificultam a etapa de descoloração pelo álcool, gerando falsos resultados de Gram-positividade devido ao acúmulo artificial de corante.
• Uso Prévio de Antimicrobianos: Pacientes que iniciaram terapia com antibióticos que agem na síntese da parede celular (como a penicilina) podem apresentar bactérias com morfologia alterada ou protoplastos (bactérias Gram-positivas sem parede), as quais perdem a capacidade de reter o corante primário e mimetizam bactérias Gram-negativas.

8. PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO (POP): COLORAÇÃO DE GRAM

8.1. OBJETIVO

Padronizar a execução técnica da coloração diferencial de Gram no setor de microbiologia clínica, estabelecendo os critérios para a correta fixação, coloração, análise morfológica/tintorial e prevenção de erros que possam comprometer a fidedignidade do laudo bacterioscópico.

8.2. MATERIAIS, REAGENTES E EQUIPAMENTOS

• Lâminas de microscopia de vidro (limpas, desengorduradas e foscas em uma das extremidades).
• Kit de Reagentes de Gram (composto por):
1. Corante Primário: Cristal Violeta (ou Violeta de Genciana).
2. Mordente: Solução de Iodo (Lugol de Gram).
3. Descorante: Solução de Álcool-Acetona.
4. Contracorante / Corante de Fundo: Safranina ou Fucsina Básica.
• Alça de platina, alça plástica descartável ou swab.
• Solução salina fisiológica ($0,85%$) estéril.
• Bico de Bunsen (ou alça elétrica/passador de lâminas).
• Suporte ou calha de coloração.
• Água destilada ou água corrente purificada (em pisseta ou fluxo suave).
• Microscópio óptico binocular.
• Óleo de imersão de alta qualidade.
• Equipamentos de Proteção Individual (EPIs) obrigatórios: jaleco de mangas longas, luvas de procedimento e óculos de proteção.

8.3. PROCEDIMENTO PASSO A PASSO

Passo 1: Confecção e Preparo do Esfregaço

1. Identificação: Escrever o número de registro do paciente ou o código da amostra na extremidade fosca da lâmina utilizando grafite ou marcador permanente resistente a álcool.
2. Depósito da Amostra: * Para colônias bacterianas (meio sólido): Depositar uma microgota de salina estéril no centro da lâmina. Com a alça bacteriológica, tocar levemente uma colônia isolada e homogeneizá-la na gota, realizando movimentos circulares para obter uma suspensão delgada.
• Para amostras líquidas ou secreções (swab): Rolar o swab delicadamente sobre a lâmina ou depositar uma gota do sedimento centrifugado, cobrindo a área central de forma homogênea.
3. Secagem: Deixar o esfregaço secar completamente ao ar livre, em temperatura ambiente.

Passo 2: Fixação pelo Calor

1. Acender o bico de Bunsen.
2. Segurar a lâmina firmemente com o auxílio de uma pinça de madeira ou metal (ou pelas extremidades livres).
3. Passar a lâmina rapidamente, com o esfregaço voltado para cima, de 2 a 3 vezes sobre a chama do bico de Bunsen.
• Nota de restrição técnica: Evitar o aquecimento excessivo. A lâmina não deve ficar excessivamente quente ao toque no dorso da mão, para prevenir a distorção morfológica e a ruptura das paredes bacterianas.

Passo 3: Protocolo Sequencial de Coloração

Colocar as lâminas fixadas sobre a calha de coloração e executar rigorosamente os tempos descritos:

1. Coloração Primária: Cobrir totalmente o esfregaço com a solução de Cristal Violeta e deixar agir por 1 minuto. Lavar suavemente com água corrente para remover o excesso de corante.
2. Etapa do Mordente: Cobrir a lâmina com a solução de Lugol e deixar agir por 1 minuto. O iodo formará um complexo insolúvel com o cristal violeta dentro do citoplasma bacteriano. Lavar suavemente com água.
3. Descoloração (Fase Crítica): Adicionar a solução de Álcool-Acetona gota a gota sobre a lâmina inclinada, até que o solvente escorra praticamente incolor (o tempo varia geralmente entre 10 a 20 segundos).
• Atenção: Lavar imediatamente com água corrente abundante para interromper a ação do descorante e interromper o processo de descoloração artificial.
4. Contracoloração: Cobrir o esfregaço com a solução de Safranina ou Fucsina Básica e deixar agir por 30 segundos. Lavar com água corrente para eliminar o excesso.
5. Secagem Final: Deixar a lâmina secar ao ar livre na posição vertical ou pressionar delicadamente entre folhas de papel filtro limpo, sem esfregar a área do esfregaço.

LEITURA MICROSCÓPICA E CRITÉRIOS DE INTERPRETAÇÃO

1. Depositar uma gota de óleo de imersão sobre o esfregaço seco.
2. Focar inicialmente no campo com a objetiva de 10X para triagem da celularidade e, em seguida, alternar diretamente para a objetiva de imersão (100X).
3. Avaliar o comportamento tintorial e as características morfológicas das bactérias:

• Bactérias Gram-positivas: Apresentam-se coradas em roxo ou azul-escuro. Isso ocorre porque possuem uma espessa camada de peptideoglicano em sua parede celular, que se desidrata e contrai na presença do álcool, retendo firmemente o complexo cristal violeta-lugol.
• Bactérias Gram-negativas: Apresentam-se coradas em rosa ou vermelho. Possuem uma parede celular delgada de peptideoglicano envolta por uma membrana lipídica externa. O álcool-acetona extrai esses lipídeos e aumenta a permeabilidade, permitindo a saída do complexo primário, sendo subsequentemente coradas pelo contracorante (safranina/fucsina).

Classificação Morfológica Obrigatória:

• Cocos: Estruturas esféricas. Observar os arranjos (pares, cadeias, agrupamentos em cachos ou tétrades).
• Bacilos: Estruturas cilíndricas/bastonetes. Observar as extremidades (retas ou arredondadas) e arranjos.
• Espirilos: Formas espiraladas ou curvas.

PREVENÇÃO DE ERROS E FALSOS RESULTADOS (CONTROLES CRÍTICOS)

O analista deve estar atento aos fatores descritos no documento base que interferem no resultado:

• Idade da Cultura: Culturas bacterianas velhas (com mais de 24-48 horas de incubação) sofrem autólise e perda da integridade da parede celular, tornando-se incapazes de reter o cristal-violeta. Manifestam-se de forma errônea como Gram-variáveis (células roxas e rosas mescladas no mesmo campo). Utilizar sempre colônias jovens.
• Espessura do Esfregaço: Esfregaços excessivamente densos ou grossos impedem a penetração uniforme dos corantes e dificultam a etapa de descoloração pelo álcool, gerando falsos resultados de Gram-positividade devido ao acúmulo artificial de corante.
• Tempo de Descoloração: O excesso de exposição ao álcool-acetona pode descorar bactérias Gram-positivas (gerando falsos-negativos), enquanto uma descoloração insuficiente pode manter bactérias Gram-negativas coradas em roxo (falsos-positivos).
• Uso Prévio de Antimicrobianos: Pacientes que iniciaram terapia com antibióticos que agem na síntese da parede celular (como as penicilinas) podem apresentar bactérias com morfologia alterada ou protoplastos (bactérias Gram-positivas sem parede), as quais perdem a capacidade de reter o corante primário e mimetizam bactérias Gram-negativas.

REGISTRO E MODELO DE LAUDO BACTERIOSCÓPICO

O resultado da análise microscópica direta pelo Gram deve ser lançado no sistema eletrônico ou ficha laboratorial contendo os seguintes campos padronizados:

• FLORA GRAM-POSITIVA: (Descrever a morfologia e arranjo. Ex: Presença de cocos Gram-positivos isolados e em pares).
• FLORA GRAM-NEGATIVA: (Descrever a morfologia e arranjo. Ex: Presença de bacilos Gram-negativos curtos).
• PREDOMÍNIO: ( ) Flora Gram-positiva ( ) Flora Gram-negativa ( ) Flora mista
• ASPECTO DA MICROBIOTA: ( ) Normal ( ) Alterada ( ) Inconclusiva
• CÉLULAS EPITELIAIS: ( ) Numerosas ( ) Várias ( ) Raras ( ) Ausentes
• LEUCÓCITOS / PIÓCITOS: ( ) Numerosos ( ) Vários ( ) Raros ( ) Ausentes por campo.